亚洲欧美日韩中文字幕国产综合一级久久精品,俄罗斯rapper潮水老狼,日韩欧美精品一区二,はじめてのおるす在线中文

上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

質(zhì)粒大量抽提操作過程及技巧詳解
點(diǎn)擊次數(shù):96 更新時間:2024-08-16

1. 取過夜菌至50毫升離心管內(nèi),5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀,棄上清。再重復(fù)一次,每管共收集100毫升過夜菌沉淀。

通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘,如沉淀不充分則適當(dāng)延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密,不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清,再倒入約50毫升菌液并重復(fù)上述操作,然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙),使液體流盡。如果細(xì)菌密度明顯偏低,可考慮使用更多菌液,再重復(fù)上述操作1-2次。對于高拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過150毫升,對于低拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過200毫升。過量的細(xì)菌會導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。

2. 每管加入5毫升溶液I,重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀wan全散開,無可見細(xì)菌團(tuán)塊。
確認(rèn)溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更長時間,懸起沉淀。一定要充分混勻,對著光亮處觀察應(yīng)呈均勻的懸濁液,無明顯細(xì)菌團(tuán)塊或絮塊。如果沒有vortex,可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開,或手指把沉淀彈開。

3. 每管加入5毫升溶液II,輕輕顛倒離心管4-6次,室溫放置1-2分鐘,使細(xì)菌wan全裂解,溶液透明。
切勿vortex!vortex或其它劇烈操作會導(dǎo)致基因組DNA斷裂,易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后,溶液應(yīng)變得透明,無團(tuán)塊或絮狀物。如果加入溶液I后細(xì)菌沒有wan全散開,那么顛倒4-6次后,可能還會有團(tuán)塊或絮狀物。遇到有少量團(tuán)塊或絮狀物產(chǎn)生的情況,可以增加顛倒次數(shù)3-5次,再室溫放置2-3分鐘,但總裂解時間不可超過5分鐘。

4. 每管加入7毫升溶液III,隨即顛倒離心管4-6次混勻,可見白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex!顛倒次數(shù)也不宜過多,否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。

5. 12,000-14,000rpm)室溫離心10分鐘。
如果離心機(jī)的最高速度較低,需要適當(dāng)延長離心時間,例如約5000-6000rpm時需要離心20-30分鐘或更長時間,直至沉淀充分。離心時可以準(zhǔn)備好質(zhì)粒純化柱,自制漏斗等,并在純化柱上標(biāo)上記號。

6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。12,000-14,000rpm離心2分鐘,倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后,可以不用等待,直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后,保留收集管繼續(xù)使用。本步驟及后續(xù)需要12,000-14,000rpm離心2分鐘的步驟,如果離心機(jī)的最高速度較低,需要適當(dāng)延長離心時間,例如約5000-6000rpm時需要離心約5分鐘或更長時間,直至液體全部穿柱。如果離心后有少量漂浮物,可以考慮再次離心,或者使用擦鏡紙兩次對折后打開形成的自制漏斗,以過濾去除漂浮物。

7. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入12毫升溶液IV,12,000-14,000rpm離心2分鐘,洗去雜質(zhì),倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待,直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后,保留收集管繼續(xù)使用。

8. 12,000-14,000rpm再次離心2分鐘,除去殘留液體并使痕量乙醇完wan全揮發(fā)。
注意:倒棄收集管內(nèi)液體后再離心,才能徹di去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質(zhì)粒的質(zhì)量。

9. 將質(zhì)粒純化柱置于50毫升離心管上,加入2毫升溶液V至管內(nèi)柱面上,放置2分鐘。
也可以用重蒸水或MilliQ級純水替代溶液V,但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長,對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會略有幫助。如想得到較高濃度的質(zhì)粒,可以加入1毫升溶液V洗脫,質(zhì)粒得率實測減少約5-10%,具體減少量與特定樣品有關(guān)。

10. 12,000-14,000rpm離心2分鐘,所得液體即為轉(zhuǎn)細(xì)胞級超純質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右,可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。如果想得到高濃度的質(zhì)粒,可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質(zhì)?;虺R?guī)的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質(zhì)粒中加入0.7毫升異丙醇),混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘,小心吸去上清液,避免觸及沉淀。
如果希望獲得較高濃度的質(zhì)粒,在洗脫時推薦采用1毫升洗脫液進(jìn)行洗脫,后續(xù)可以轉(zhuǎn)移到2毫升離心管內(nèi)進(jìn)行異丙醇沉淀,這樣操作起來相對比較方便。異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀,和乙醇沉淀產(chǎn)生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔,避免沉淀松動或部分顆粒狀懸浮至溶液中。不推薦直接倒棄上清,直接倒棄上清時經(jīng)常出現(xiàn)直接把質(zhì)粒沉淀倒掉的情況;如果偏好直接倒棄上清,建議把上清倒棄至一潔凈離心管內(nèi),這樣萬一沉淀被倒出,仍然可以從潔凈離心管中回收。推薦用移液槍吸去上清,并注意盡量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常溫70%乙醇溶液,輕輕懸起質(zhì)粒沉淀以充分洗滌,12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘,小心吸去上清液,避免觸及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃離心5-10秒,用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體,避免觸及沉淀。
d. 肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內(nèi)即可完成干燥),加入適當(dāng)體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q級純水)溶解DNA。
DNA樣品不能過于干燥,否則很難溶解。最好在弱堿性條件下溶解DNA,溶解時可用緩沖液反復(fù)沖洗管壁,使管壁上的DNA充分溶解。

附表1. EndA- and EndA+ strains of E. coli.

EndA-    EndA+
BJ5183    BL21(DE3)
DH1    CJ236
DH20    HB101
DH21    JM83
DH5α    JM101
JM103    JM110
JM105    LE392
JM106    MC1061
JM107    NM522 (all NM series are EndA+)
JM108    NM554
JM109    P2392
MM294    PR700 (all PR series are EndA+)
SK1590    Q358
SK1592    RR1
SK2267    TB1
SRB    TG1
XL1-Blue    BMH 71-18
XLO    ES1301

上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司 版權(quán)所有 地址:上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號 郵編:201202 電話: 管理登陸
傳真:021-58999639 手機(jī):13310162040 聯(lián)系人:俞燕熙 郵箱:m13310162040@163.com  GoogleSitemap 網(wǎng)址:www.fullpowercn.com ICP備案號:滬ICP備14029423號-1
主營:ELISA試劑盒/染色液/溶液 /動物血清/標(biāo)準(zhǔn)品/化學(xué)試劑
點(diǎn)擊這里給我發(fā)消息
手機(jī):13310162040